12月12 【成功案例】云平臺(tái)助力蕪菁花芽轉(zhuǎn)錄組比較分析解析多倍體異常減數(shù)分裂過(guò)程
ranscriptome?Analysis?of?Floral?Buds?Deciphered?an?Irregular?Course?of?Meiosis?in?Polyploid?Brassica?rapa?
云平臺(tái)助力蕪菁花芽轉(zhuǎn)錄組比較分析解析多倍體異常減數(shù)分裂過(guò)程
雜志：?Frontiers?in?Plant?Science?
影響因子：4.298
PMID:28553302
云平臺(tái)助力鄭州大學(xué)的老師們發(fā)表了一篇關(guān)于四倍體與二倍體蕪菁轉(zhuǎn)錄組比較分析的文章，這是第一個(gè)同時(shí)在細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄組水平證明染色體多倍性對(duì)減數(shù)分裂過(guò)程有不利影響的研究，有助于全面了解二倍體和多倍體蕪菁減數(shù)分裂時(shí)花芽轉(zhuǎn)錄組的一致性和差異性。
研究背景：
多倍體化對(duì)于動(dòng)植物進(jìn)化及物種形成具有重要意義。染色體倍性增加在大多數(shù)植物中十分常見(jiàn)，約30-80％的被子植物在進(jìn)化過(guò)程中歷經(jīng)這一過(guò)程，種內(nèi)基因組復(fù)制可產(chǎn)生同源多倍體，種間雜交可產(chǎn)生異源多倍體。理解多倍體對(duì)植物繁殖的影響對(duì)于多倍體育種項(xiàng)目具有重要意義。
本文在細(xì)胞和分子水平對(duì)同源四倍體、二倍體蕪菁的生殖組織（未成熟的花芽）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組比較分析。先進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果顯著異常后，進(jìn)行RNA測(cè)序分析，進(jìn)一步闡明這種細(xì)胞學(xué)差異的分子機(jī)制。
材料和方法:
材料：溫室中培育蕪菁同源四倍體和二倍體，采集1-1.5mm的花芽。
細(xì)胞學(xué)分析：花芽制片觀察染色體行為。
轉(zhuǎn)錄組分析：二倍體花芽樣本T1，T2，T3,同源四倍體樣本T4，T5，T6進(jìn)行測(cè)序，篩選DEGs，進(jìn)行功能注釋及相關(guān)驗(yàn)證。
測(cè)序平臺(tái)：Illumina?HiSeq?2000
分析平臺(tái)：BMKCloud，具體分析如下：
測(cè)序原始數(shù)據(jù)去接頭、低質(zhì)量序列后與參考基因組比對(duì)（TopHat2），對(duì)比對(duì)上的序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)，評(píng)估表達(dá)水平（Cufflinks）。鑒定DEGs（logFC≥2，F(xiàn)DR<0.01）并與Nr、UniProtKB\Swissprot、KOG、COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋。
研究結(jié)果：
1.同源四倍體蕪菁異常的減數(shù)分裂過(guò)程
減數(shù)分裂過(guò)程中染色體行為分析結(jié)果顯示：二倍體中，同源染色體中期配對(duì)為二倍體，后期分離（圖1A-D）。四倍體中，在減數(shù)分裂中期I形成多倍體和單倍體，在后期I、II發(fā)生不均等分離（圖1E-L）。
圖1?四倍體蕪菁異常染色體行為
統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明與二倍體相比，蕪菁多倍體化后整個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程發(fā)生了不規(guī)則變化。
圖2?四倍體蕪菁減數(shù)分裂中異常染色體行為分析
2.測(cè)序結(jié)果
每個(gè)樣本文庫(kù)得到29.07?GB?clean?read，Q30≥88.55%?。同源四倍體、二倍體比對(duì)到參考基因組效率分別為74.34%，75.88%。樣本組的表達(dá)模式分析共得到40927個(gè)基因，其中有1001個(gè)新基因。
3.DEGs分析
40927個(gè)基因中，4601個(gè)基因是差異表達(dá)的（圖3A），2343個(gè)上調(diào)，2259個(gè)下調(diào)（圖3B），兩組間DEGs占比較少（(11.24%）。隨機(jī)挑選DEGs進(jìn)行層次聚類(lèi)，分析表達(dá)模式（圖3C），發(fā)現(xiàn)四倍體中K1、K3、K6、K9類(lèi)別下調(diào)，K2、K4、K5、K7，K8類(lèi)別顯著上調(diào)。
圖3?DEGs表達(dá)分析
與COG、GO、KOG、Nr、KEGG、Swiss-Prot比對(duì)后，97%的DEGs至少能與一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)上（表1）
表1?差異表達(dá)Unigene注釋
COG分類(lèi)中，2615個(gè)DEGs可歸到25個(gè)COG類(lèi)別（圖4），其中包含最多DEGs的類(lèi)別為：復(fù)制重組與修復(fù)（222個(gè),8.49%），轉(zhuǎn)錄（261個(gè),9.98%），一般功能（515個(gè),19.69%)，與KEGG結(jié)果一致。
GO分類(lèi)中大多數(shù)DEGs聚類(lèi)到細(xì)胞過(guò)程（61.97％），繁殖過(guò)程（15.49％），結(jié)合過(guò)程（42.96％）（圖5）。
KEGG功能注釋結(jié)果表明，4,601個(gè)DEGs中有1,453個(gè)可歸到50個(gè)生物途徑。高度富集的通路為：氨基酸合成（48個(gè)，3.3％），植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（61個(gè)，4.2％）和蛋白質(zhì)加工內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑（47個(gè)，3.2％）（圖6）。
圖4?COG分類(lèi)
圖5?新DEGs的GO分類(lèi)
圖6?KEGG富集通路
4.減數(shù)分裂相關(guān)DEGs分析
為闡述四倍體蕪菁減數(shù)分裂過(guò)程改變相關(guān)的遺傳信息，選擇以下明顯與減數(shù)分裂相關(guān)的COG類(lèi)別進(jìn)行細(xì)分：（1）復(fù)制，重組和修復(fù);（2）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué);（3）細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂，染色體分區(qū);（4）細(xì)胞骨架。在4,601個(gè)位點(diǎn)中，共鑒定出288個(gè)與減數(shù)分裂相關(guān)的基因（圖7A）。
應(yīng)用擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR）的BLASTN搜索，進(jìn)一步鑒定蕪菁中減數(shù)分裂直系同源基因，11個(gè)兩組間差異表達(dá)的已知減數(shù)分裂基因。如圖7所示，顯著富集的L組（復(fù)制，重組和修復(fù)）包含121個(gè)上調(diào)、102個(gè)下調(diào)基因，這組聚類(lèi)結(jié)果（圖8B）顯示已知減數(shù)分裂基因（包括RAD54，DMC1和RPA）在四倍體蕪菁中表達(dá)顯著下調(diào)。D組（細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂和染色體分配）中，10個(gè)下調(diào)，13個(gè)上調(diào)，已知的減數(shù)分裂基因DIF1/SYN1和CyclinA1-2/TAM上調(diào)（圖7C）。在B組（染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化）（圖7D），有7個(gè)基因上調(diào)，包括已知調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間和植物發(fā)育的NF-YB8基因，14個(gè)基因下調(diào)，包括組蛋白相關(guān)基因（H2AV和H4）。Z組（細(xì)胞骨架）中，8個(gè)基因上調(diào)，7個(gè)基因下調(diào)（圖7E），且沒(méi)有已知減數(shù)分裂相關(guān)基因。已知減數(shù)分裂基因MMD1和HOP2在一般功能組（R）中富集（圖4）。HOP2，XRI1，ZYP1a和ZYP1b未歸到任何COG組。
KEGG比對(duì)后將288個(gè)中的108個(gè)DEGs分配到28個(gè)途徑，包括減數(shù)分裂相關(guān)同源重組（2.8％），DNA修復(fù)和重組（6.5％），DNA復(fù)制（3.7％），染色體和相關(guān)蛋白（4.6％）。
圖7?COG分類(lèi)中減數(shù)分裂相關(guān)基因分布及表達(dá)分析
同源重組對(duì)于真核生物減數(shù)分裂中SPO11蛋白質(zhì)引起的DSBs的精確修復(fù)十分重要，作為調(diào)節(jié)關(guān)鍵介質(zhì)的DMC1，RAD54和RPA在這個(gè)途徑中顯著下調(diào)。Cyclin-A1-2?/?TAM是DNA復(fù)制途徑中唯一與細(xì)胞周期蛋白有關(guān)的基因，表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明染色體集在同源四倍體中增加了一倍，與減數(shù)分裂有關(guān)的大多數(shù)基因可能通過(guò)上調(diào)或至少正常表達(dá)以滿足減數(shù)分裂期間基因組含量增加的需求。否則，減數(shù)分裂關(guān)鍵基因下調(diào)可能會(huì)干擾四倍體減數(shù)分裂中染色體行為。
qRT-PCR?對(duì)24個(gè)減數(shù)分裂相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證，20多個(gè)基因表達(dá)與測(cè)序結(jié)果一致。對(duì)擬南芥中直系同源基因分析結(jié)果顯示兩個(gè)物種減數(shù)分裂相關(guān)基因的總體表達(dá)模式相近。
結(jié)果：
本研究細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，合成多倍體整體減數(shù)分裂過(guò)程是顯著不規(guī)則的。為從分子水平闡明這一過(guò)程的遺傳基礎(chǔ)，本文進(jìn)行了同源四倍體和二倍體蕪菁花芽間的遺傳調(diào)節(jié)差異的轉(zhuǎn)錄組比較分析。在40927個(gè)表達(dá)基因中，同源四倍體蕪菁花芽中鑒定出4601個(gè)DEGs，其中288個(gè)與減數(shù)分裂相關(guān)。DMC1（已知減數(shù)分裂特異性基因，與DSBs同源染色體依賴性修復(fù)相關(guān)）在同源四倍體蕪菁中表達(dá)顯著下調(diào)，可能與減數(shù)分裂I期的異常有關(guān)。某些RNA解旋酶，細(xì)胞周期、體細(xì)胞DNA修復(fù)相關(guān)的DEG在基因組復(fù)制后表達(dá)上調(diào)，減數(shù)分裂DSB修復(fù)有關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)。蕪菁和擬南芥中減數(shù)分裂相關(guān)基因的總體表達(dá)模式相近。
創(chuàng)新點(diǎn)：
這是第一個(gè)在細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄組水平證明染色體多倍性對(duì)減數(shù)分裂過(guò)程有不利影響的研究，有助于全面了解二倍體和多倍體蕪菁減數(shù)分裂時(shí)花芽轉(zhuǎn)錄組的一致性和差異性。
參考文獻(xiàn)：Braynen?J,?Yang?Y,?Wei?F,?et?al.?Transcriptome?Analysis?of?Floral?Buds?Deciphered?an?Irregular?Course?of?Meiosis?in?Polyploid?Brassica?rapa[J].?Frontiers?in?Plant?Science,?2017,?8:768.